游離氨基酸的測(cè)定方法主要有柱前衍生反相色譜法、柱后衍生離子交換色譜法、離子色譜-積分脈沖安培檢測(cè)法、液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法、柱前衍生氣相色譜法、衍生化毛細(xì)管電泳法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、超臨界流體色譜法等，其中柱前衍生反相色譜法和柱后衍生離子交換色譜法為藥品中氨基酸測(cè)定常用方法。

艾杰爾公司于2024年12月17日新推出的 Durashell AA 氨基酸分析方法是基于目前廣泛使用的以 OPA（鄰苯二醛）和 FMOC（9- 芴基甲基氯甲酸鹽）為衍生劑的柱前衍生 HPLC 氨基酸分析方法。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、無(wú)需要手工衍生，可全自動(dòng)化在線(xiàn)分析、衍生試劑無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)液相進(jìn)樣器自動(dòng)衍生程序的設(shè)置，大大減少研究人員在衍生過(guò)程中的操作步驟及誤差。

圖 1. OPA 在巰基試劑存在下與一級(jí)氨基酸的衍生反應(yīng)圖

圖 2. FMOC 與二級(jí)氨基酸的衍生反應(yīng)圖

同時(shí)，氨基酸分析也常用于測(cè)定蛋白質(zhì)、多肽及其他藥物制劑中氨基酸組成或含量。多肽作為由多個(gè)氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成的一類(lèi)化合物，通常由 10~100 個(gè)氨基酸分子組成，連接方式與蛋白質(zhì)相同，相對(duì)分子質(zhì)量一般低于 10000。根據(jù) 2023 年 CDE 發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，在合成多肽原料藥的質(zhì)控考察項(xiàng)目中，氨基酸分析數(shù)據(jù)可用于計(jì)算多肽藥物的氨基酸比值。氨基酸分析的水解方法可參考相關(guān)技術(shù)指南進(jìn)行（例如《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）第一增補(bǔ)本（四部）中新增“9120 氨基酸分析指導(dǎo)原則"）。

蛋白質(zhì)或多肽樣品中的氨基酸是以結(jié)合形式存在，必須經(jīng)過(guò)水解處理，形成游離氨基酸后才能進(jìn)行氨基酸測(cè)定。蛋白質(zhì)或多肽的水解方法主要采用酸水解，同時(shí)輔以堿水解。其中，酸水解中使用廣泛的是鹽酸水解，所得其產(chǎn)生的氨基酸不消旋，但該方法引起會(huì)使一些氨基酸的被全部破壞或部分破壞，如色氨酸被全部破壞，絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸被部分破壞，門(mén)冬酰胺和谷氨酰胺脫酰胺分別轉(zhuǎn)化為門(mén)冬氨酸和谷氨酸。對(duì)于這些氨基酸可采用較特殊的處理方法或者使其轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的形式，然后再進(jìn)行鹽酸水解。

色譜柱：Durashell AA, 4.6*150 mm; 3 μm; 100 ?

柱溫：45 ℃

波長(zhǎng)：

一級(jí)氨基酸: 338 nm, 帶寬 10 nm; 參比波長(zhǎng): 390 nm, 帶寬 20 nm

二級(jí)氨基酸: 262 nm, 帶寬 16 nm, 參比波長(zhǎng): 324 nm, 帶寬 8 nm

狹縫：4 nm, 峰寬＞0.03 min

梯度洗脫程序：

輔助：

吸液速度：200 μL/min

噴液速度：600 μL/min

吸液位置：0.0 mm

表 1. 混合氨基酸對(duì)照溶液保留時(shí)間

圖 3. 混合氨基酸對(duì)照溶水解液相色譜圖（一級(jí)氨基酸）

圖 4. 混合氨基酸對(duì)照溶液水解液相色譜圖（二級(jí)氨基酸）

圖 5. 利那洛肽水解溶液液相色譜圖（一級(jí)氨基酸）

圖 6. 利那洛肽水解溶液液相色譜圖（二級(jí)氨基酸）

表 2. 利那洛肽樣品溶液 110 ℃ 下水解測(cè)試數(shù)據(jù)

表 3. 利那洛肽樣品溶液 150 ℃ 下水解測(cè)試數(shù)據(jù)