實時熒光定量PCR

定量PCR已經從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術，即實時定量PCR。實時熒光定量PCR技術于1996年推出，由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產物的量，并據此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產物進行分離。目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應用于分子生物學研究的各個領域。

實時熒光定量PCR 技術的主要應用：

1. DNA 或RNA 的絕對定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測,轉基因動植物轉基因拷貝數的檢測，RNAi 基因失活率的檢測等。

2. 基因表達差異分析：例如比較經過不同處理樣本之間特定基因的表達差異(如藥物處理、物理處理、化學處理等 )，特定基因在不同時相的表達差異以及cDNA 芯片或差顯結果的確證。

3. 基因分型：例如SNP 檢測，甲基化檢測等。

Realtime PCR 常用的兩種方法

SYBR Green（熒光染料摻入法）

在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。

此方法特點：

1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強到1000倍以上

2、通用性好,不需要設計探針,方法簡便,省時,價格低廉。

3、通用型方法，在國內外科研中普遍使用。

4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測.

5、專一性要求不高的定量PCR檢測。

Taqman probe （探針法）

PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。

此方法特點：

1、具有高適應性和可靠性，實驗結果穩(wěn)定重復性好，特異性更高。

2、適用于擴增序列專一的體系的檢測。

3、樣品中靶基因含量過低的定量PCR檢測。

4、靶基因的特異序列較短，無論怎樣優(yōu)化引物設計條件都不能解決。

5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現非特異性擴增，對特異性要求較高的定量。

6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量,在動物病原體基因的檢測,畜禽產品的檢驗檢疫,生物制品的鑒定。

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